Guía práctica de reactivos para aplicaciones con anticuerpos: WB, IHC, IF, FCM e IP

Cuando un experimento con anticuerpos falla, muchas veces no es por el anticuerpo en sí, sino por un detalle de operación: el buffer equivocado, un bloqueo subóptimo, una dilución mal preparada o un paso que se omitió. Este artículo resume, de forma operativa y por etapas, un “mapa” de reactivos recomendados para distintas aplicaciones: Western Blot (WB), Inmunohistoquímica (IHC), Inmunofluorescencia (IF), Citometría de flujo (FCM) e Inmunoprecipitación (IP). La intención es simple: que puedas revisar tu flujo paso a paso, identificar el reactivo correcto por operación y estandarizar tu rutina.

1) Western Blot (WB): reactivos por operación

El flujo de WB puede dividirse en: extracción de proteína, cuantificación, carga/electroforesis, transferencia a membrana, bloqueo, incubación de anticuerpo primario, incubación de anticuerpo secundario y detección por quimioluminiscencia. A continuación se enlistan ejemplos de reactivos por etapa, incluyendo buffers 10X y consumibles frecuentes.

Extracción y cuantificación de proteína

• RIPA Lysis Buffer y RIPA Lysis Buffer (Strong) (E-BC-R327).
• BCA Protein Colorimetric Assay Kit (E-BC-K318).
• Tinción opcional: Fast Coomassie Blue Staining Solution (10×) (E-IR-R129).

Carga, electroforesis y geles

• 5× SDS Loading Buffer (E-BC-R288) / 2× SDS Loading Buffer (E-IR-R329).
• Electrophoresis Buffer (10×) (E-BC-R331).
• Pre-stained Protein Marker 10–250 kDa (E-IR-R331) y 10–180 kDa (E-BC-R273).
• SDS-PAGE Gel kit (E-IR-R305).

Transferencia, verificación y bloqueo

• PVDF Membrane 0.45 μm (E-BC-R266) y 0.22 μm (E-BC-R329).
• Transmembrane Buffer (10×) (E-BC-R333).
• Verificación opcional: Ponceau S Solution (E-IR-R127).
• Skim Milk Powder (E-BC-R337), 5% Blocking Buffer (E-IR-R107), Blocking Powder (E-IR-R108).

Lavados, diluciones, secundarios y detección

• Buffers de lavado: PBS Buffer pH 7.4 (10×) (E-BC-R187), PBST (10×) (E-IR-R310), TBS (10×) (E-IR-R116), TBST (10×) (E-BC-R335).
• Dilución de anticuerpo: Western Blotting Antibody Dilution Buffer (E-IR-R121) y Western Antibody Dilution Buffer (Block Quickly) (E-IR-R125).
• Secundarios HRP: Goat Anti-Mouse-HRP (E-AB-1001), Goat Anti-Rabbit-HRP (E-AB-1003), Rabbit Anti-Goat-HRP (E-AB-1004).
• Detección: Excellent ECL kit (E-IR-R307) y Super Excellent ECL kit (E-IR-R308).

2) Inmunohistoquímica (IHC): flujo y reactivos asociados

En IHC, el “orden” importa: procesamiento de muestra, desparafinado y rehidratación, recuperación antigénica, bloqueo de peroxidasa, incubación de anticuerpo primario, incubación de secundario, detección DAB, tinción nuclear, deshidratación/clarificación y montaje.

Procesamiento, recuperación y bloqueos

• Fijación: Tissue Fixation Solution / 4% Paraformaldehyde (without DEPC) (E-IR-R113) y (with DEPC) (E-IR-R114).
• Antigen Retrieval: pH 9.0 (E-IR-R104) y pH 6.0 (E-IR-R105).
• Producto 2-en-1 (desparafinado/recuperación): One-step Dewaxing/Antigen Retrieval pH 9.0 (E-IR-R220A) y pH 6.0 (E-IR-R221A).
• Bloqueo de peroxidasa endógena: Endogenous Peroxidase Blocking Buffer (E-IR-R115).
• Bloqueos: 5% Blocking Buffer (E-IR-R107), Normal Goat Blocking Buffer Ready-to-Use (E-IR-R110), Normal Rabbit Blocking Buffer Ready-to-Use (E-IR-R128), Blocking Powder (E-IR-R108), Blocking Kit (E-IR-R300), Normal Goat Blocking Buffer (E-IR-R111), Normal Rabbit Blocking Buffer (Concentrated) (E-IR-R124).

DAB, tinción nuclear y montaje

• Antibody Dilution Buffer (E-IR-R106).
• DAB Detection Kit (20×) (E-IR-R101).
• Tinción nuclear: Hematoxylin Staining Buffer (E-IR-R120) y Hematoxylin & Eosin Staining Buffer (E-IR-R117).
• Montaje: Neutral Balsam (E-IR-R118).

3) Inmunofluorescencia (IF): del fijado a la imagen

El mapa de IF se organiza en: fijación, permeabilización, bloqueo, incubación de anticuerpos, contratinte y adquisición de imagen. En este flujo aparecen, por ejemplo, soluciones de fijación con paraformaldehído, opciones de permeabilización y un contratinte nuclear.

• Fijación: Tissue Fixation Solution / 4% Paraformaldehyde (without DEPC) (E-IR-R113) y (with DEPC) (E-IR-R114).
• Permeabilización: Proteinase K Reagent (10 mg/mL) (E-IR-R109) y Triton X-100 (E-IR-R122). También se menciona Proteinase K Lyophilized Powder (E-IR-R109U).
• Bloqueo: Normal Goat Blocking Buffer Ready-to-Use (E-IR-R110), 5% Blocking Buffer (E-IR-R107), Blocking Powder (E-IR-R108), Normal Goat Blocking Buffer (E-IR-R111), Blocking Kit (E-IR-R300).
• Dilución de anticuerpo: Antibody Dilution Buffer (E-IR-R106).
• Contratinte nuclear: DAPI Reagent (1 μg/mL) (E-IR-R103).
• Imagen: Anti-Fluorescence Quenching Agent (E-IR-R119).

4) Citometría de flujo (FCM): preparación, bloqueo y viabilidad

En FCM, el flujo operativo típico se visualiza como: cosecha de muestra, preparación celular, tratamiento, fijación/permeabilización, tinción de superficie, tinción intracelular, detección y análisis de datos. El mapa incluye reactivos útiles desde lisis de eritrocitos hasta buffers de tinción.

Preparación y tratamiento celular

• 10× ACK Lysis Nuclear stainingBuffer (E-CK-A105).
• 10× RBC lysis/Fixation Solution (E-CK-A106).
• Human PBMC Separation Solution (P 1.077) (E-CK-A103).
• Cell Stimulation and Protein Transport Inhibitor Kit (E-CK-A091), Cell Stimulation MIX Kit (E-CK-A019), Protein Transport Inhibitor MIX (E-CK-A013).

Bloqueo Fc, buffers y fijación/permeabilización

• Fc receptor blocking: Purified Anti-Mouse CD16/32 Antibody (2.4G2) (E-AB-F0997A) y EasyStain Human Fc Receptor Blocking Solution (E-CK-A171).
• Cell Staining Buffer (E-CK-A107).
• Foxp3/Transcription Factor Staining Kit (E-CK-A108) e Intracellular Fixation/Permeabilization Buffer Kit (E-CK-A109).

Viabilidad: dos enfoques y ejemplos de colorantes

Se compara el uso de colorantes de viabilidad basados en ácidos nucleicos (tinción nuclear) vs. colorantes amino-reactivos (unión a proteínas). Los primeros son impermeables a membranas de células vivas y, cuando la célula muere, el colorante entra al núcleo y se une a DNA/RNA de manera reversible; los amino-reactivos entran cuando la membrana se compromete y se unen a aminas libres de forma irreversible. Ambos son compatibles con paneles de superficie, pero el esquema indica diferencias frente a paneles intracelulares (con una nota: “Only can be used on unfixed, non-permeabilized cells”).

• Tinción nuclear (ejemplos): 7-AAD (E-CK-A161), PI (E-CK-A162), DAPI (E-CK-A163).
• Kits de viabilidad fijables (amino-reactivos): STYX™ Green (E-CK-A166), STYX™ Violet (E-CK-A167), STYX™ Near-IR (E-CK-A168), STYX™ Yellow (E-CK-A169), STYX™ Red (E-CK-A170).

5) IP (Inmunoprecipitación): guía rápida de decisión

El mapa de IP separa escenarios de detección: (1) muestra de proteína recombinante exógena marcada (labeled), (2) proteína natural (natural protein sample) y (3) otras modificaciones (por ejemplo, glycosylation o biotinylation). Para proteína natural, se sugiere adquirir primero el anticuerpo de IP (“Buy the IP antibody first”) y, como soporte, se indican opciones tipo Pro A, Pro G, Pro L y Pro A/G tanto como “recommended product” como “recommended reagent kit”. Para modificaciones, se listan soportes como streptavidin o concanavalin A en formato de beads magnéticas o gel de agarosa.

• Soportes recomendados: Pro A, Pro G, Pro L, Pro A/G.
• Biotinylation: Streptavidin Magnetic beads / agarose gel.
• Glycosylation: Concanavalin A Magnetic beads / agarose gel.

6) Purificación de proteína: kits por etiqueta (tag)

Para purificación de proteínas recombinantes exógenas marcadas, el mapa asocia etiquetas frecuentes con kits específicos, y menciona principios como “antibody-antigen affinity principle”, “structural similarity principle” y “enzyme-substrate specificity binding principle”.

• EA-TP-K001: DYKDDDDK-tagged Protein Purification Kit (flag).
• EA-TP-K002: HA (YPYDVPDYA)-tagged Protein Purification Kit.
• EA-TP-K003: MYC (EQKLISEEDL)-tagged Protein Purification Kit.
• EA-TP-K005: His (HHHHHH)-tagged Protein Purification Kit.
• EA-TP-K004: GST-tagged Protein Purification Kit.

Checklist final para estandarizar tu flujo

• Define la aplicación (WB/IHC/IF/FCM/IP) y sigue el orden de operación paso a paso.
• Verifica buffers de lavado y dilución (por ejemplo PBS/PBST vs TBS/TBST, y buffers de dilución de anticuerpo).
• Asegura consumibles críticos (membrana PVDF, markers, kits de gel o tinción, etc.).
• En FCM, decide desde el inicio si usarás Live/Dead y qué tipo de colorante (nuclear vs amino-reactivo).
• En IP y purificación, selecciona el soporte (Pro A/G/L) o kit según el tipo de muestra y etiqueta/modificación.

Con este mapa como referencia, puedes convertir una lista dispersa de reactivos en un flujo reproducible. El valor real está en la disciplina: operar siempre igual, registrar qué cambiaste y mantener consistencia entre corridas.