Secuenciación de Nueva Generación (NGS): Preparación de Bibliotecas con RC-PCR y Doble Índice Único

La secuenciación de nueva generación (NGS), también conocida como secuenciación masiva en paralelo (MPS), es una tecnología avanzada que permite determinar la secuencia del ADN o ARN (convertido a ADNc) para estudiar variaciones genéticas asociadas a funciones biológicas y enfermedades.

A diferencia del método tradicional de secuenciación Sanger, que analiza un único fragmento de ADN por vez mediante electroforesis capilar, la tecnología NGS permite secuenciar millones de fragmentos simultáneamente, ofreciendo mayor rendimiento, precisión y capacidad para detectar variantes con baja frecuencia alélica.

Ventajas de la Secuenciación NGS frente a Sanger

• Secuenciación masiva en paralelo de millones de fragmentos
• Menores requerimientos de muestra
• Mayor precisión analítica
• Detección de variantes con baja frecuencia alélica
• Mayor escalabilidad y reducción de costos por muestra

Preparación de Bibliotecas NGS: El Paso Crítico del Flujo de Trabajo

El primer paso fundamental en cualquier flujo de trabajo de NGS es la preparación de la biblioteca, proceso que incluye amplificación PCR múltiple, limpieza, selección de tamaño y validación.

Los métodos convencionales basados en amplicones requieren dos reacciones de PCR: una para amplificar las regiones de interés y otra para añadir adaptadores e índices. Este enfoque incrementa el riesgo de contaminación cruzada y errores entre etapas.

RC-PCR: Preparación de Bibliotecas en una Sola Reacción Cerrada

La tecnología RC-PCR (Reverse Complement PCR) desarrollada por NimaGen simplifica la preparación de bibliotecas NGS al integrar amplificación multiplex, ligación de adaptadores e indexación en una única reacción cerrada en un solo tubo.

Este método reduce significativamente el tiempo de manipulación, minimiza el riesgo de contaminación y ofrece un flujo de trabajo robusto, seguro y altamente reproducible.

• Amplificación PCR multiplex en una sola reacción
• Incorporación simultánea de adaptadores
• Indexación integrada
• Menor riesgo de error humano
• Optimización del tiempo operativo

Secuenciación con Doble Índice Único (UDI)

La secuenciación indexada permite agrupar múltiples bibliotecas en una sola corrida, reduciendo costos y optimizando recursos. Para multiplexación avanzada se recomienda el uso de placas con doble índice único (UDI).

Una placa UDI permite agrupar hasta 96 muestras utilizando adaptadores únicos para índice 1 (i7) e índice 2 (i5), aumentando la eficiencia de secuenciación y reduciendo errores de asignación.

Cuando se combina el uso de placas UDI con tecnología RC-PCR, se obtiene un flujo de trabajo optimizado que incrementa la productividad y reduce el costo por muestra en comparación con estrategias tradicionales de indexación.

Limpieza y Selección del Tamaño de la Biblioteca NGS

Después de la amplificación RC-PCR, las muestras se agrupan para realizar la limpieza y selección de tamaño en un solo tubo, generalmente mediante química basada en perlas magnéticas.

Tecnologías como AmpliClean™ o AMPure XP permiten obtener bibliotecas listas para secuenciación tras cuantificación y control de calidad.

Las bibliotecas NGS requieren entradas de ácido nucleico de alta calidad, con concentraciones y tamaños variables dependiendo de la plataforma de secuenciación y el método de preparación utilizado.

Portafolio de Soluciones para Preparación de Bibliotecas NGS

• RC-BRCA096
• RC-16SMB096

En BRI Bioresearch ofrecemos soluciones especializadas para optimizar tu flujo de trabajo de secuenciación NGS, garantizando eficiencia, precisión y reproducibilidad en cada etapa del proceso.